在生物醫學領域，生物樣本的成像長期以來一直是一項支柱技術，不僅加深了我們對基礎生物學的理解，而且在設計對抗感染和疾病的策略和療法方面也發揮著關鍵作用。
顯微鏡在歷史上是二維的，但我們周圍的世界不是。我們想更多地了解我們的樣本，在所有三個維度上都具有高分辨率，并且隨著時間的推移（第四維度），如果樣本是活的。在未來幾年，我們預計 3D 顯微鏡需求將出現重大技術發展。與此同時，超聲斷層掃描、顯微CT和正電子發射斷層掃描等非顯微鏡3D成像方法的分辨率也無疑會有所提高，從而縮小這些技術與光學顯微鏡的分辨率差距。
在光學顯微鏡中，穿過 5 微米厚的樣本（例如組織或細胞層）的光束可以揭示有關樣本的大量信息。但是，我們還不能檢測所有細節并正確量化它們。盡管研究人員可以通過簡單地滾動多個焦平面來了解有關樣本的很多信息，但無法輕松捕獲和解釋高分辨率（亞細胞）下所有維度的綜合圖片。取而代之的是，通常會獲取幾個單一的焦平面圖像，隨著樣本厚度的增加，每個圖像的“模糊”也會增加，這是由于失焦信息主導圖像的結果。借助電動聚焦和圖像反卷積算法，可以計算每個平面的聚焦分量，
所需的 3D 信息可以從多個物理或光學串行部分集成。對于物理切片，每個切片都需要單獨收集和單獨成像，結果會補償缺失的切片、壓縮區域和意外的樣品旋轉、傾斜或扭曲。然后整個卷在 silico中渲染。具有高處理能力和專業軟件的計算機*近賦予了我們執行此類任務的能力，再次增強了我們向令人滿意的 3D 成像邁進的能力。
另一個問題是確定所需的分析體積和 XYZ 分辨率之間的**折衷。對于大面積的高 XY 分辨率，可以使用電動載物臺在高倍率下進行 XY 掃描。這不再代表技術挑戰，因為在此類應用中通常使用干式物鏡。盡管油浸式鏡頭通常提供更高的分辨率，但傳統的礦物油并不能均勻地散布在大樣品周圍。*近，硅油和水浸透鏡已經上市，從而減少了這種限制的影響。
但是，各種軟件算法準確“縫合”大量圖像的能力存在差異。然而，可以在幾分鐘內完成對大小為幾 cm 2的樣本的單次掃描。Z 分辨率將由截面的厚度定義。
3D 顯微鏡的*終目標——在每個方向上獲得相同的高分辨率——在理論上是可以實現的；但是，如果樣本量很大，這仍然是一項具有挑戰性的任務。例如，在單個實驗中，一個 1cm 3組織樣本要以 500nm 步長連續成像，需要 20,000 個切片，每個切片都要收集、染色和成像。因此自動化是必不可少的。與收集連續切片相比，更有希望的解決方案是將塊面成像與連續塊剃須相結合。這種方法的明顯優勢是串行圖像的很好的對齊。缺點在于難以標記或染色整個組織塊。為了克服這一點，可以在樣品準備成像之前使用自發熒光或將熒光標記引入樣品。在任何一種情況下，都不需要后標記，這在厚樣品中總是很困難的。
