一、樣本制備：奠定**觀察的基礎
抗凝劑選擇與血樣處理
血液樣本需立即加入抗凝劑（如EDTA-K2或枸櫞酸鈉），避免凝血影響細胞形態。EDTA-K2適合血常規檢測，而枸櫞酸鈉用于凝血功能測試。血樣需在2小時內完成涂片，防止細胞自溶或形態改變。
涂片制備技巧
推片法：將血滴置于載玻片一端，用另一載玻片以30°-45°角緩慢推勻，形成薄層血膜。紅細胞應單層分布，白細胞密度控制在每高倍視野（400×）5-10個。
干燥控制：涂片后需自然晾干，避免高溫烘干導致細胞收縮或破裂。干燥不充分的樣本易出現紅細胞聚集，影響分類計數。
固定與染色策略
瑞氏-吉姆薩染色：將染色液與緩沖液按1:1混合，覆蓋涂片染色10-15分鐘。該染色法可清晰區分白細胞類型（如淋巴細胞與單核細胞的細胞質差異）。
特殊染色：對于寄生蟲檢測（如瘧原蟲），需采用吉姆薩原液染色30分鐘，并結合暗場顯微鏡觀察細胞內病原體。
二、顯微鏡操作：從光源到成像的細節把控
光源與物鏡選擇
光源強度：初始觀察時采用低強度光源（約30%亮度），避免熒光淬滅或細胞結構過曝。
物鏡匹配：低倍鏡（10×）用于全片掃描，高倍鏡（40×或100×油鏡）用于細胞形態分析。油鏡使用需確保浸油無氣泡，否則易導致圖像模糊。
觀察模式優化
明場觀察：適用于紅細胞形態分析（如大小、色素、包涵體）及血小板估計。
暗場觀察：增強寄生蟲（如瘧原蟲環狀體）與背景的對比度，提升檢測靈敏度。
相差觀察：通過相位環調整，清晰呈現無色透明樣本（如未染色血涂片中的網織紅細胞）。
成像與數據記錄
對焦策略：先低倍鏡粗調對焦，再切換高倍鏡微調。油鏡使用前需確保物鏡前端與載玻片接觸，避免損壞鏡頭。
圖像采集：采用4K數碼成像系統，確保細胞結構（如白細胞核分葉、血小板衛星現象）清晰可辨。每例樣本至少采集5個視野，涵蓋不同區域。
三、常見問題與解決方案
樣本干燥與染色不均
原因：涂片過厚或染色時間不足。
解決：重新制備薄層涂片，延長染色時間至15分鐘，并確保染色液均勻覆蓋。
細胞識別困難
紅細胞：注意大小、色素（如低色素紅細胞）、形態（如球形紅細胞）及包涵體（如豪焦小體）。
白細胞：結合細胞大小、核質比、顆粒類型（如中性粒細胞的中性顆粒）進行分類。
血小板：估計血小板數量時，需在油鏡下計數10個視野，取平均值。
寄生蟲漏檢
瘧原蟲檢測：采用厚薄血膜聯合染色法，厚血膜提高檢出率，薄血膜確認蟲種。
微絲蚴檢測：需在夜間采集血樣，結合低倍鏡慢速掃描（掃描速度≤5mm/s）。
四、安全與維護：確保設備與樣本安全
生物安全處理
廢棄血涂片需浸泡于84消毒液中30分鐘，再按醫療廢物處理。
操作過程中佩戴手套，避免直接接觸樣本，防止血源性病原體傳播。
顯微鏡日常維護
物鏡清潔：使用專用擦鏡紙與乙醚-酒精混合液（7:3）擦拭，避免劃傷鏡片。
載物臺校準：定期使用標準尺校驗載物臺移動精度，確保掃描區域準確性。
通過樣本制備、顯微鏡操作、問題解決及安全維護的規范化流程，光學顯微鏡在血液觀察中可實現從形態學篩查到定量分析的全面應用。這種系統化操作不僅提升了診斷效率與準確性，更為血液病研究、寄生蟲檢測等領域提供了可靠的技術支持。
