光學顯微鏡對焦時的注意事項主要包括以下幾點：
初始對焦：
在初次使用顯微鏡時，需要先進行初始對焦。這通常是通過粗調焦機構將物鏡移動到離標本較遠的位置，然后通過目鏡調焦機構將孔徑調小。
接著，可以通過粗調焦機構把物鏡逐漸移動到與標本的表面接觸，并繼續觀察目鏡中的圖像。若圖像尚未清晰，而且對焦機構已經到達極限，可以嘗試將標本向上或向下移動，直到圖像變得清晰銳利。
調整聚光：
聚光是控制樣品表面與物鏡之間距離的過程，也是控制樣品與暗場光源的距離。這個距離的改變直接影響著顯微鏡觀察的清晰度。
在調整聚光的過程中，需要逐漸減小孔徑，以增加深度聚焦的范圍。特別是在觀察比較厚的樣品時，需要通過調整聚光來改變光線的入射角度，從而獲得Z優的對焦圖像。
微調對焦：
當初次對焦完成后，需要進行微調對焦以獲得更清晰的圖像。這主要通過物鏡調焦機構來完成，需要慢慢地向前或向后旋轉物鏡調焦機構，從而微調樣品與顯微鏡鏡頭的距離。
當圖像變得更清晰時，可以通過適當的微調向前或向后移動標本，直到獲得Z佳的對焦結果。
避免振動：
對焦過程中需要盡量保證顯微鏡穩定，避免振動影響圖像清晰度。
可以通過使用顯微鏡的多點支撐、放置在堅實的桌子上、減小觀察時的呼吸頻率等措施來減少機械振動。
注意物鏡和標本的距離：
在調焦時，要注意物鏡和標本之間的距離，避免物鏡直接接觸到標本，以免損傷標本或物鏡。
特別是在使用高倍物鏡時，要特別小心，因為此時物鏡與標本之間的距離非常近，稍有不慎就可能造成損傷。
選擇合適的調焦手輪：
在對焦過程中，應根據需要選擇合適的調焦手輪。一般來說，粗調焦手輪用于快速調整焦距，而細調焦手輪則用于精確調整焦距。
在使用高倍物鏡時，應避免使用粗調焦手輪，以免移動距離過大而損傷物鏡和玻片。
觀察并調整圖像：
在對焦過程中，要密切觀察目鏡中的圖像變化，并根據需要進行調整。
如果圖像不清晰或存在其他問題，可以嘗試調整光源、光圈、反光鏡等部件，以獲得更好的觀察效果。
綜上所述，光學顯微鏡對焦時需要注意多個方面，包括初始對焦、調整聚光、微調對焦、避免振動、注意物鏡和標本的距離、選擇合適的調焦手輪以及觀察并調整圖像等。只有掌握了這些注意事項并正確操作顯微鏡，才能獲得清晰的圖像以及更加精確的觀測結果。
